化转感受态的制备原理2020-03-06

化转感受态的制备原理

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源 DNA 的载体分子通过。

实验步骤

1.取1mL过夜培养液，接入100ml LB (或SOB)液体培养基中。 37°C，220rpm，振摇2-4小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.5~0.7之间时，停止培养。

2.将培养液转入预灭菌的离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下4000rpm离心7分钟。

3.弃去上清,在沉淀的菌种中加入15ml的Tfb1缓冲液重悬细菌（用移液器轻轻吹吸），冰上冷却一段时间（BL21 DE3 30min；DH5α 10min）后,4℃下4000rpm离心5分钟。

4.弃去上清,加入2mlTfb2缓冲液重悬细菌，冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

5.感受态细胞分装成100μl的小份,此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞在液氮中快速冷冻后，于-80°C冰箱中长期保存。

6.检测转化效率：取100uL新鲜制备的感受态细胞，加入1ng已知浓度的质粒DNA，冰上孵育后进行42℃热击，冰上冷却2min后将细菌重悬在900uL LB（或SOC）培养液，培养45min-1h复苏细菌，分别取10uL和100uL涂板，估计转化效率。