Elisa实验常见问题及解决方案显色淡，灵敏度偏低 1 试剂盒未充分平衡 试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）
2 样品不适合做ELISA检测 样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分）
3 酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥 防止板过于干燥
4 包被抗体遭到破坏 操作温和，移液枪不能碰到孔底
5 样本和抗体孵育条件不合适 按照说明书条件，建议孵育过程中全程振荡孵育。
6 洗涤浸泡时间过长 按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间；
7 偶联HRP试剂污染 弃去试剂，重新配置
8 错误的稀释偶联HRP试剂 弃去试剂，重新配置
9 TMB底物孵育时间过短，因非人为因素影响，需要优化孵育时间 确定合适的孵育时间：人为判定-最高浓度的标准品出现深蓝色；S4-5有淡蓝色；机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65
10 样本浓度过高或存在基质效应 建议做不同稀释倍数，确认样本最佳稀释倍数。
11 酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对 确认仪器设置及选择正确的波长检测。
12 酶标板不适合做ELISA 不能使用细胞培养板，建议使用ELISA专用高吸附力板子。
背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2） 1 洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留 洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。
2 底物污染，未避光保存，出现颜色 弃去底物，重新配置
3 样品稀释液污染 弃去稀释液，重新配置
4 吸头重复使用，未洗净或消毒不彻底 吸头尽可能一次性使用
5 不正确的孵育时间，温度（尤其是底物孵育的时间） 最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。完全按照说明书要求。
6 偶联抗体（streptavidin-HRP）浓度过高 按照说明书调整到最佳的浓度
7 ELISA板子不正确的贮存 酶标板贮存于2-8 ℃；使用结合力低点的Elisa板
8 没有正确封闭 在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间
9 样本溶血严重 建议使用非溶血或轻微溶血样本，严重溶血样本会导致背景偏高。
重复性不佳，高CV值 1 样品不均一 加样前充分混匀样品，取样确保移液位置一致；
2 包被板表面遭到破坏 洗板加样时尽量小心，避免破坏板的包被表面
3 孔与孔之间的交叉污染 孵育后取下盖子小心操作，避免孔与孔的污染；封板膜不能重复使用
4 加样量不一致 样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴
5 边缘效应（外周孔显色较中心孔深） 孵育时尽量100 rpm旋转混匀
6 微量加样不准确 保证微量加样的准确性和均一性
7 不正确的洗涤 洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，确定每一步的洗涤
出现白板，阳性对照不显色 1 显色液变质 更换新的显色液
2 洗涤液配制有误 请按说明书所示稀释倍数配制
3 未加酶结合物而认为已加入 注意不要漏加
4 终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用 每次加液前均应看清标签
5 标准品稀释方法错误/或标准品有问题 请按照说明书所示配置说明书，注意单位和稀释倍数
6 不同试剂盒或不同批号的试剂混用 建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。
不正常的标准曲线 1 错误的方法重悬标准品 加入正确量的溶液重悬标准品，重悬充分
2 标准品稀释错误 按照说明书要求稀释标准品
3 标准品污染 使用一次性的灭菌吸头， 标准品贮存于2-8 ℃
4 错误的倍比稀释步骤 按照说明书倍比稀释标准品
5 波长选择错误 TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而 前者比色波长为450nm，后者为492nm。双波长比色分析优于单波长。
6 标准品混用 不同批号试剂勿混用
7 试剂盒在运输途中时间太长，温度太高，标准品失活 尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温
8 ELISA未终止而直接检测450nm和620nm TMB显色需终止后检测，否则会出现620nm比450nm读数高的现象。（数值仍有梯度规律）
样品或标准品OD超出正常范围 1 错误的样品或标准品的稀释 完全按照说明书稀释
2 偶联抗体浓度过高 按照说明书调整到最佳的浓度
3 TMB底物孵育时间过长 调整到合适的孵育时间
4 样品或标准品污染 避免污染
5 错误的孵育时间或温度
