引物是 PCR反应成功与否的关键，为了保证扩增的准确性和效率，引物设计应遵循以下原则：
一、引物设计：在 NCBI上搜索不同物种的相同基因，通过序列分析软件得到相同基因的序列，即为该基因的保守区。
二、引物长度：15-28 bp，大于38 bp时，退火温度升高，不利于普通 Taq酶扩增。
三、引物中 GC的含量为40%-60%, Tm最接近72℃。
四、由于密码子的简并性，引物的3’端最好避开密码子的第三位(最好是 T)。
五、碱基分布不均匀，3’端不超过3 G或 C。
六、引物本身不形成发夹结构，引物设计完整，要通过 BLAST验证。
PCR扩增对模板要求不高，可以采用单链或双链 DNA作为扩增片段，但 PCR可以扩增少量的 DNA，为保证扩增的专一性，对不同来源的模板，起始浓度有一定要求，如下：
模版可以是纯化过的样品，也可以是粗制滥造的样品，不同来源的模版采用不同的处理方法，试验模版纯化越简单越好，但模版中若有 Taq酶抑制剂，蛋白酶，核酸酶等，会干扰反应。取模时要注意保存，不要放置过久，避免反复冻融，防止降解。大多数人都会忽略这个问题，当实验结果不带条纹时，可以优先考虑是否是模板降解的原因。
