逆转录酶(RT-PCR)是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶。RT-PCR 实验中的逆转录酶需要具有以下三种活性：
1. 依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 的第一条链；
2. Rnase 水解活性：水解 Rnase 杂合体中的 RNA;
3. 依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以一条 DNA 链为模板合成互补的双链 DNA。
在选择逆转录酶时，建议选择无 RNaseH①活性（RNaseH-）的逆转录酶。具有 RNaseH 活性的逆转录酶的 RNaseH 活性会与聚合酶活性竞争 RNA 模板与 DNA 引物（或 cDNA 延伸链）形成的杂合链，并降解杂合链中的 RNA 链。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作为合成 cDNA 的有效底物，降低了 cDNA 合成的产量与长度。
一、实验流程：
1、从细胞材料中提取 RNA→RNA 加入到含有逆转录酶、引物、dNTPs 的反应体系中→退火，引物与 RNA 链配对→延伸，逆转录酶合成互补 cDNA 链变性→常规 PCR 反应流程（变性、退火、延伸，如此多次循环）。
2、RT-PCR“两步法"与“一步法"
RT-PCR 的实验操作分为“一步法"与“两步法"两种。一步法 RT-PCR 能克隆微量 mRNA 而不需构建 cDNA 文库（即 cDNA 合成与 PCR 反应在同一 Buffer 及酶中进行，一步法完成），省略了 cDNA 与 PCR 之间的过程。两步法 RT-PCR 首先用反转录酶合成 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 PCR，即 RNA 反转录与 PCR 扩增分两步进行。一步法 RT-PCR 与两步法相比快速、简便、减少了污染机会、减少了 RNA 二级结构、减少了 PCR 反应的错配率。RT-PCR 两步法的优势在于存在中间产物 cDNA，便于保存；且第二步 PCR 只取逆转录反应产物的 1/10 进行反应，有利于 PCR 条件的调整，实验重现性强；两步法可以在第二步 PCR 反应体系中加入特异性引物，其灵敏度比一步法高；两步法的实验预算要低于一步法。但是由于两步法包括第一链 cDNA 合成和随后的 PCR 反应，容易产生污染问题。
二、实验操作注意事项：
1、 RNA 提取一定要迅速，样本要新鲜，组织尽量在液氮中研磨；
2、 RNA 提取完马上进行逆转录不要拖延，新提的 RNA 很容易降解；
3、逆转录反应过程，需建立无 RNAase 环境，以避免模板 RNA 降解；
