反应效率视为实时荧光定量PCR 分析设计和优化的关键因素。利用标准曲线(通过对目标模板进行连续梯度稀释获得) 获取效率值。该效率值可作为总反应的“健康”标志。低效率与高效率所造成的影响有所不同。改善上述两种情形的步骤则相差甚远。理想的反应效率为100%，但反应效率在90–110% 范围内都是可以接受的。
确定某个特定的分析效率是否低下的方法是稀释模板生成标准曲线(模板稀释的范围应涵盖所有未知样本)，然后查看该范围内的效率。它应尽可能接近100%。熔解曲线出现多个峰或凝胶显示多种产物意味着反应源物质之间存在竞争作用，这必将对反应效率产生影响。一旦确定反应被抑制或效率较低，则可采取一些步骤将效率值重新调整到理想范围内。
1、对于抑制作用，可去除模板浓度zui高的反应孔并重新分析标准曲线。如果效率重新回到110% 以下，则分析良好。
2、另一种解决方案是重新纯化模板。切记应延长干燥时间，以去除乙醇沉淀过程中的乙醇，或采用另外的柱上洗涤液将离液盐从硅胶纯化物中去除。
3、通过分析优化可解决效率低下的问题。此过程有时相对简单，但在某些情况下，随着分析复杂度的提高，优化过程可能十分耗时费力。
4、扩增单个产物时，将镁的浓度提升至6mM 可提高反应效率，但当出现竞争作用时，则应降低镁的浓度。
5、在某些情况下(主要是多重反应中)，必须采用引物和探针优化基质。此时，需检测正向引物与反向引物的比值或浓度，有时甚至还需检测探针比值，以找出分析的理想浓度组合。引物浓度介于100至600nM之间，而探针浓度则在100nM至400nM 之间。
6、根据引物的Tm 值，确保热循环条件(尤其是退火温度)适当，且引物设计时使之有相似的Tm 值。
