总巯基测试盒（比色法）

 总巯基测定试剂盒说明书

                                                微量法100T/48S

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质，而且参与活性氧清除，后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和GSH含量，能够间接测定蛋白质巯基含量。

测定原理：

巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412nm处有最大吸收峰。

自备实验用品：

天平、研钵、恒温水浴锅、酶标仪、96孔板、乙醇和蒸馏水。

试剂组成和配制： 

试剂一：液体18mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体1mL×1管，4℃避光保存。 

样品的制备：

1. 按照组织质量（g）：水体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL蒸馏水）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 血清，培养液：稀释5倍后测定，可取0.1mL样本，加入0.4mL蒸馏水，混匀，置冰上待测。

操作步骤：

1. 酶标仪预热30min，调节波长至412nm。
2. 操作表

在96孔板中加入如下试剂

	对照管	测定管
样品（μL）	40	40
试剂一（μL）	150	150
试剂二（μL）		10
乙醇（μL）	10
混匀，25℃静置10min，测定412nm吸光值。ΔA=A测定-A对照。每个测定管设一个对照管。

计算公式：

总巯基标准曲线：y = 1.8111x - 0.0037，R2 = 1，x为标品浓度，单位μmol/mL，y为吸光度ΔA。

1. 组织：

（1）按样本重量计算

总巯基含量（μmol/g 鲜重）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×V样总÷W

=0.552×（ΔA+0.0037）÷W

 

（2）按样本蛋白浓度计算

总巯基含量（μmol/mg prot）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×V样总÷Cpr

=0.552×（ΔA+0.0037）÷Cpr

                                         

2. 血清、培养液：

总巯基含量（μmol/L）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×5×103

=2761×（ΔA+0.0037）

 

V样总：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g ；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；5：血清，培养液等液体样本稀释倍数；103 ：1mmol/ L=103μmol/ L

注意事项

最低检出限为10μmol/L。