线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细胞色素C氧化酶测试盒（比色法）

线粒体复合体Ⅳ试剂盒说明书

                                          微量法 100管/96样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C的氧化，并最终把电子传递给氧，生成水。

测定原理：

还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体100mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体20mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体1.5mL×1瓶，-20℃保存；

试剂四：液体20mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1. 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2. 将匀浆600g，4℃离心5min。
3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心10min。
4. 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做）。
5. 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅳ酶活性测定。

测定步骤：

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。
2. 样本测定

（1）工作液的配制：临用前将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和200μL工作液，混匀，记录550nm处初始吸光值A1和 37℃反应30min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

注意点：

1. 若ΔA大于0.2，需将样本用试剂二稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使A1-A2小于0.2，可提高检测灵敏度。
2. 动物肝脏样本由于酶活性过高， 1分钟内吸光值就会到达平台期，务必先进行2个样本的预测定。可将样本用试剂二稀释10~50倍，反应时间缩到到30秒或1分钟（计算公式中代入实际反应时间，并乘以相应稀释倍数）。其他样本可按照正常测定步骤进行。

复合体Ⅳ活力单位的计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化降解1 nmol 还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

 复合体Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

 复合体Ⅳ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=3.88×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.008×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.2×10-4 L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

b.使用96孔板测定的计算公式如下：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化降解1 nmol 还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

 复合体Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=38.39×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

 复合体Ⅳ活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=7.76×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.016×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.2×10-4 L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。